Mekanisme RNAi



Bagaimana berlangsungnya RNAi? Hipotesis tentang adanya perantara antisense, yang oleh pembentukan dsRNA memicu degradasinya atau mengganggu proses translasi, telah lama muncul pada mekanisme antisense (seperti apa yang telah dikerjakan oleh Guo dan Kemphues, 1995). Namun Hamilton dan Baulcombe (1999) curiga, katanya: “’kalau teorinya cuma begitu, yang berarti ukuran RNAnya seperti umumnya mRNA, mereka seharusnya sudah terdeteksi oleh uji Northern yang rutin dilakukan!” Dari sanggahan ini memunculkan dugaan baru: “jangan-jangan proses pembungkaman gen pasca-transcripsi melibatkan RNA yang ukurannya terlalu kecil untuk dideteksi dengan mudah”. Dirancanglah suatu pembuktian kehadiran RNA berukuran kecil itu pada sebagian besar gejalah pembungkaman gen pascatranskripsi yang diinduksi virus atau transgen, termasuk pula kosupresi gen CHS (Hamilton dan Baulcombe, 1999). Dalam percobaan mereka, RNA total diekstraksi, RNA berukuran besar dibuang, sebaliknya RNA berukuran kecil diperkaya jumlahnya –dengan pemekatan- melalui teknik ion-exchange chromatography, kemudian dilakukan prosedur Northern. Hasilnya benar! Percobaan tersebut membuktikan kehadiran potongan RNA antisense berukuran kurang lebih 25 nt (nukleotida; yang kemudian dikenal dengan istilah siRNA: small-interfering RNA) yang bersesuai dengan mRNA sasaran pembungkaman pada setiap kasus kosupresi, namun tidak terdapat pada kontrol.

Perburuan tentang asal-usul siRNA kemudian dimulai. Dirancanglah suatu metode yang memungkinkan percobaan in vitro dapat dilakukan menggunakan lysate embrio Drosophila (Tuschl et al., 1999). Dengan sistem ini, perendaman dsRNA 500 pasangan basah (pb) dari penggalan gen luciferase diikuti perendaman dengan mRNA luciferase mengakibatkan degradasi mRNA luciferase. Menggunakan sistem yang sama, Zamore et al., (2000) dan Elbashir et al., (2001) membuktikan bahwa selama reaksi RNAi, kedua rantai dsRNA diproses menjadi potongan-potongan nukleotida 21-23 pb. Proses mana tidak membutuhkan mRNA sasaran, tetapi ATP. Dalam penelitian Zamore et al., juga dibuktikan bahwa mRNA sasaran dihancurkan hanya di daerah yang memiliki identitas yang sama dengan dsRNA pada interval 21-23 pb. Hal ini memberi dugaan bahwa potongan 21-23 pb yang berasal dari potongan dsRNA merupakan penuntun penghancuran mRNA dimaksud.

Dari beberapa penelitian penyuntikan dsRNA, ternyata tiap ukuran dsRNA memiliki efektifitas yang berbeda dalam menginterferensi mRNA. Walaupun ukuran dsRNA yang pendek (kurang dari 150 pb) kurang efektif dibanding dsRNA yang lebih panjang dalam mendegradasi mRNA (Ngo et al., 1998), ukuran dsRNA sependek 38 pb masih memberi efek. Pada ukuran dsRNA 29 – 36 efeknya sudah tidak efektif dalam menghambat ekspresi RNA sasaran. Untuk itu, Elbashir et al., (2001) melakukan penelitian untuk menemukan ukuran dsRNA yang paling efektif dalam menghasilkan potongan nukleotida 21-23 nt, menggunakan dsRNA yang panjangnya berkisar antara 29-501 pb. Hasilnya ialah bahwa pada ukuran dsRNA antara 39-501 langsung terlihat produksi potongan 21-23 nukleotida, sebaliknya pada dsRNA kurang dari 29 pb produksinya sangat berkurang.

Muncul tiga pertanyaan penting: Pertama, apa peranan dari potongan RNA berukuran 21-23 nt (atau siRNA)? Kedua, apa dan bagtaimana sistem yang mendegradasi RNA spesifik sekuens, yang menggunakan dsRNA sebagai penuntun dalam pentargetan dan penghancuran RNA tertentu tersebut?

Untuk menjawab pertanyaan di atas, Lipardi et al., (2001; lihat http://www.hhmi.ucla.edu/simpson/weeg%20seminar%202002/rnai-1.htm) menunjukkan bahwa siRNA memerlukan ujung 3’OH untuk menimbulkan RNAi, dan siRNA bertindak sebagai primer mentransformasi mRNA sasaran menjadi dsRNA, yang kemudian didegradasi dan menghasilkan siRNA. Mereka juga menemukan bahwa siRNA yang diinkorporasikan ke dalam dsRNA dilakukan oleh aktivitas RNA-dependent RNA polymerase. Sejalan dengan penelitian ini, Elbashir et al., (2001) mensintesis secara kimiawi ds-siRNA 21 dan 22 nt kemudian menguji kemampuan mereka memediasi degradasi RNA sasaran. Pada konsentrasi 10 – 100 nM ds-siRNA tersebut mampu menghancurkan RNA sasaran persis di antara dua ujung siRNA (nukleotida ke 11 atau). Demikian pula, siRNA yang dihasilkan oleh pemotongan dsRNA oleh RNase III (yang menghasilkan potongan dsRNA berbelai dua nukleotida dengan gugus 3’) lebih efektif mendegradasi RNA target ketimbang yang tanpa belai. Hasil penelitian-penelitian tersebut memberi dugaan bahwa belaian 2-3 ujung 3’siRNA memberi keuntungan dalam rekonstruksi kompleks nuclease RNAi dan mungkin diperlukan dalam pengikatan ds-siRNA berafinitas tinggi pada komponen-komponen enzim.

Selanjutnya, dalam reaksi enzimatik, hanya salah satu dari dua rantai dsRNA yang terlibat dalam proses penghancuran RNA target. Dengan demikian, ds-siRNA (atau siRNA rangkap) di dalam kompleks reaksi ribonuklease harus didenaturasi oleh reaksi helikase, dan s-siRNA bertindak sebagai penuntun degradasi RNA target oleh RNase. Penemuan peran siRNA rangkap mendegradasi mRNA secara efisien dan terpisah dari tahapan pemrosesan dsRNA menghasilkan teknologi siRNA yang aplikatif.

Berdasarkan studi terhadap mekanisme RNAi di atas, maka RNAi melibatkan dua sistem yang terppisah secara biokmia: (1) sistem yang menghasilkan siRNA, dan (2) sistem yang memungkinkan siRNA berperan sebagai penuntun degradasi mRNA target. Sistem yang pertama adalah enzim yang menghancurkan dsRNA panjang menjadi ds-siRNA, yaitu endonuklease RNase III yang disebut Dicer (Bernstein et al., 2001). Sistem yang kedua adalah kompleks ribonuklease yang memisahkan ds-siRNA menjadi rantai tunggal, dan mengintegrasikan s-siRNA ke dalam kompleks pembungkam gen yang dipicuh RNA (atau RISC= RNA-induced silencing complex). Ribonuklease ini berfungsi memberikan determinan spesifisitas yang mengarahkan suatu nuklease memotong mRNA yang berpadanan dengan siRNA (Hammond et al., 2000). Berdasarkan pemahaman ini, muncul pemikiran mengenai cara-cara menghadirkan siRNA di dalam lingkungan seluler, serta peningkatan efektifitas dan spesifisitas siRNA membungkam mRNA target.