siRNA Sebagai Suatu Teknologi



Paling tidak ada tiga hal penting yang berhubungan dengan siRNA sebagai suatu teknologi: (1) Bagaimana meningkatkan efektivitas dan spesifisitas siRNA sebagai alat pembungkam ekspresi gen? (2) Bagaimana menghadirkan siRNA ke dalam lingkungan seluler manakala diperlukan? (3) Dalam hal apa saja teknologi siRNA telah dan dapat diterapkan? 1. Peningkatan efektivitas dan spesifisitas siRNA

Proses pengakuan target oleh siRNA bersifat sangat spesifik sekuens, dan bahkan ketidaksesuaian satu nukleotida antara ganda siRNA dengan mRNA target menghilangkan interferensi (Semizarov, et al., 2003). Namun demikian, tidak semua posisi dalam suatu siRNA memberikan sumbangan yang sama pada pengakuan target. Ketidaksepadanan pasangan pada bagian tengah rantai ganda siRNA mencegah pemotongan rRNA target (Elbashir (2001).

Studi komputasional terhadap aksesibilitas target siRNA pada sasaran dipengaruhi oleh struktur sekunder siRNA dan target (Far and Sczakiel, 2003). siRNA yang aktif [dengan nilai penghambatan separuh (IC50) = 0.2-0.5 nM] dapat memiliki akses 1000 kali lipat ketimbang siRNA yang tidak aktif (IC50 ≥ 1 μM; Far and Sczakiel, 2003). Membadingkan antara siRNA dengan oligonukleotida antisense ternyata bahwa siRNA yang aktif dapat memiliki aktifitas 100 kali lipat ketimbang oligonukleotida antisense. Namun demikian, walaupun siRNA aktif memiliki hubungan positif dengan konsentrasi, tetapi pada aras tertentu konsentrasi siRNA tidak lagi berpengaruh.

Rantai ganda 21 nt terdiri dari 19 pasangan basah dan 2 nt belalai 3’ merupakan struktur RNAi yang paling efisien pada ekstrak Drosophila (Elbashir et al., 2001). Namun sebaliknya, Czauderna et al., (2003) menunjukkan bahwa menggunakan siRNA rantai ganda sintetik tanpa belalai nukleotida 2 nt memiliki sifat sangat efisien dalam menimbulkan interferensi pada sel-sel mamalia. Mereka juga menunjukkan bahwa dengan memblok terminal 5’ antisense menyebabkan reduksi tajam aktifitas interferensi. Proteksi pada terminus yang lain tidak menyebabkan efek pembungkaman gen. Czauderna et al., juga menunjukkan bahwa siRNA sintetik dengan modifikasi ujung 2’-0-methyl internal (dan bukan dengan modifikasi terminal) terproteksi terhadap nuklease; bahkan modifikasi 2’-O-methyl pada posisi tertentu meningkatkan stabilitas siRNA, tanpa kehilangan berarti aktifitas RNAi.

Elbashir et al., (2002) berdasarkan penelitian mereka pada sel mamalia, memberikan petunjuk kasar mengenai hal-hal yang harus diperhatikan dalam merancang siRNA, yaitu: (1) perlunya mencegah daerah tidak ditranslasi diujung 5’ dan 3’ suatu mRNA, (2) daerah di dalam 75 basa dari kodon “mulai”, (3) sekuensnya mengandung kadar GC lebih besar dari 70% atau kurang dari 30%. Namun demikian konsistensi terhadap syarat-syarat tersebut dapat saja dilanggar. Dengan menyadari bahwa tidak semua posisi dalam suatu siRNA memberikan sumbangan yang sama pada pengakuan target dan efektifitas RNAi. Untuk itu, pemilihan siRNA atau small-hairpin-RNA yang paling efektif perlu dikembangkan secara lebih empirik, dan hal tersebut telah dikerjakan oleh Kumar et al., 2003). Identifikasi dan pemilihan siRNA atau sh-RNA dilakukan dengan mengekspresikan suatu gen target terpadu dengan gen pelapor (reporter gene; berbasis fluorpendar atau enzimatik), kemudian dimonitor pengaruh dari suatu atau sejumlah probe siRNA/sh-RNA. Dengan cara ini, dapat ditemukan, dalam waktu yang sangat cepat, di daerah mana dari suatu gen, siRNA atau shRNA dapat dikembangkan untuk membungkam ekspresi gennya. Selanjutnya, mentransfeksi sel dengan siRNA dan paduan gen target dan gen pelapor dalam suatu microarray, memungkinkan dengan sangat cepat penentuan mana siRNA yang efektif dan mana siRNA yang tidak efektif pada suatu gen target.



2. Menghadirkan siRNA ke dalam lingkungan seluler

Dalam upaya menghadirkan siRNA ke dalam lingkungan seluler, dua cara telah dilakukan (1) mensuplai ds-siRNA dari luar lingkungan seluler, (2) mengekspresikan secara terus-menerus siRNA dengan mentransformasi organisme atau sistem biologis tertentu.

Untuk mensuplai siRNA sintetik dari luar ke dalam lingkungan seluler, siRNA sintetik dapat diproduksi in vitro dengan menghidrolisis dsRNA menjadi siRNA menggunakan enzim RNase III dari E. Coli (disebut juga endoribonuclease-prepared siRNA; esiRNA). esiRNA telah diuji bekerja efektif pada sel mamalia (Yang et al., 2002; Calegary et al., 2002). siRNA dapat pula diproduksi secara sintetik (misalnya oleh Genset Oligos -Proligo, Boulder, CO, USA-; atau dari MWG Biotech –Ebersberg Germany). Cara cepat dan lebih murah memproduksi siRNA ialah dengan mensintesis oligonukleotida, mentranskripsikannya in vitro, lalu dilakukan pemotongan RNA (sense) dan RNA (antisense) oleh deoxyribozyme (Sohail et al., 2003).

Untuk mengekspresikan secara terus-menerus siRNA dalam suatu sistem biologi, sejumlah vektor penghasil ds-RNA telah dikembangkan dan ditransformasikan ke dalam sel-sel parasit penyebab penyakit, sel-sel hewan, termasuk sel-sel manusia. Plasmid DNA penghasil dsRNA telah dapat diintegrasikan dan stabil di dalam genom nyamuk Anopheles (Brown et al., 2003). Demikian pula, plasmid terinduksi tetrasiklin penghasil dsRNA berstruktur stem-loop telah dikembangkan (Shi et al., 2000). Dalam konstruksi tersebut, suatu gen dibuat dua copy berhadapan namun diperantarai oleh suatu stuffer yang akan membentuk bengkokan. Hasil transkripsi dari konstruk tersebut membentuk dsRNA berstruktur stem-loop (Lihat Gambar 1). Menggunakan prinsip yang sama, yaitu tetracycline-inducible vector, namun dengan konstruk yang menghasilkan short-hairpin RNA telah dirancang, dan dapat melumpuhkan aktifitas gen sasaran secara lebih terkendali (Matsukura et al., 2003).

Versi yang lebih maju, yang memungkinkan suatu produk Polymerase Chain Reaction cDNA dapat langsung disisipkan kedalam vektor (jadi mempercepat konstruksi kaset ekspresi) telah dikembangkan (Wang, et al., 2000). Dalam rancangan ini, suatu gen ditranskripsi oleh dua promoter T7 yang saling berhadapan, dan transkripnya membentuk ds-RNA. Uji menggunakan gen yang terlibat dalam biosintesis poliamin pada parasit protozoa penyebab penyakit rasa mengantuk (sleeping sickness), menyebabkan pengurangan mRNA sangat tajam serta menyebabkan penghambatan pertumbuhan atau kematian sel.





Gambar 1. Short-hairpin dsRNA



Desain dengan prinsip yang sama dengan Wang et al., 2000, dan menghasilkan short hairpin dsRNA (sh-dsRNA) telah didesain untuk vektor sel-sel Drosophila dan manusia. Ekspresi dsRNA dibuat berada dibawah setiran promotor RNA polymerase III atau tRNAVal atau U6 (Paddison et al., 2002; Kawasaki and Taira, 2003). Transformasi menghasilkan pembungkaman ekspresi gen target yang stabil dan terwariskan. Bahkan, vektor yang dirancang oleh Matsukura et al., memiliki represor kondisional, yang memungkinkan dicegahnya letalitas potensial sesaat setelah transfeksi ke dalam sel dan mentarget gen-gen yang sangak krusial bagi kelangsungan sistem biologi sasaran. Vektor lain, pSUPER, yang dirancang oleh Brummelkamp et al., (2002) selain menghasilkan siRNA berukuran 19 nt (ukuran ideal) juga mengandung ujung 3’ belaian. Dengan vektor ini dapat dibuktikan bahwa siRNA bersifat sangat sekuens spesifik.





3. Aplikasi teknologi RNAi



Terdapat sejumlah area dimana teknologi RNai dapat diterapkan, yaitu: (1) Penemuan fungsi gen; (2) Penghambatan aktivitas gen yang terlibat di dalam infeksi penimbulan penyakit infeksi; (3) Penghambatan ekspresi gen-gen yang telah mengalami mutasi dan menimbulkan penyakit; (4) Penghambatan terhadap gen-gen yang terekspresi secara terus-menerus dan yang menimbulkan gangguan seluler, seperti kanker dan persoalan penuaan.

Cepatnya kemajuan di dalam teknologi perunutan DNA (dan cDNA), menimbulkan gap yang jauh antara teridentifikasinya putative gene (yang dapat ditranskripsi dan mengandung ORF) dengan fungsinya yang sebenarnya. Pada genom manusia misalnya, terdapat kurang lebih 40.000 gen pengkode protein, namun fungsi dari kebanyakan mereka belum diketahui. Teknologi RNAi telah dikembangkan untuk mempercepat penemuan fungsi gen-gen baik pada aras gen tunggal maupun pada tataran keseluruhan genome atau transcriptosome. Sebagai contoh, sejumlah gen-gen yang terlibat di dalam sitokinesis dan proteolisis yang dimediasi proteasome (Silva et al., 2004) telah diidentifikasi menggunakan transfeksi siRNA/shRNA dipadukan dengan microarray sel hidup. Dalam teknik ini, sel-sel mamalia yang dikulturkan dipermukaan preparat microarray dan ditransfeksikan berbagai siRNA atau shRNA ke dalamnya. Penghambatan dengan sirNA atau shRNA tertentu menimbulkan fenotipe tertentu, yang merupakan pengenal dari fungsi gen tersebut. Demikian pula, melalui pendekatan yang tidak jauh berbedah, teridentifikasi gen-gen yang terlibat di dalam transduksi signal faktor transkripsi NF-ĸB (Zheng et al., 2004). Selanjutnya, pendekatan lain telah dilakukan untuk meneliti sebagian besar gen-gen yang terlibat di dalam stabilitas genom sel-sel somatik C. elegans (Pothof et al., 2003). Dalam pendekatan ini, dsRNA (yang sudah tersedia pada 16765 strain bakteri atau 86% dari total 19.427 gen yang diprediksi berada di dalam genom C. elegans) ditransfeksikan ke dalam sistem pelapor aktifitas gen/ada-tidaknya mutasi. Dari penelitian ini, teridentifikasi 61 gen yang berperan dalam reparasi DNA, replikasi, organisasi kromatin, dan pengendalian siklus pembelahan sel. Disamping kedua pendekatan di atas, sejumlah besar penelitian-penelitian gene knock-down untuk meneliti fungsi masing-masing gen banyak yang sedang dikerjakan, seperti misalnya gen-gen yang terlibat dalam kekebalan nyamuk malaria terhadap bakteri (Blandin et al., 2002; Shin et al., 2003).

Dalam bidang medis dan farmasi, sejumlah aplikasi RNAi sedang dikembangkan:

1. Dalam penelitian tanggapan kekebalan yang dimediasi sel-sel dendritik, aktifitas IL-12 sel dendritik dibungkam, yang kemudian meningkatkan produksi IL-10. Peningkatan ini merangsang sel-sel dendritik memproduksi sitokin Th2 dari sel-sel T (Hill et al., 2003). Sitokin Th2 merangsang sel B tumbuh, berdiferensiasi menjadi plasma.

2. Sejumlah usaha sedang diarahkan untuk pengobatan infeksi virus-virus berbahaya pada manusia menggunakan teknologi RNAi. siRNA sintetik telah dirancang untuk membungkam gen-gen yang bertanggung-jawab dalam infeksi, dan replikasi virus (review, lihat Kitabwalla and Ruprecht, 2002; Coburn and Cullen, 2003). Pembungkaman faktor elongasi transkripsi P-TEFb HIV tipe-1 menghambat replikasi virus HIV (Chiu et al., 2004); Pembungkaman gen-gen gag dan env menghambat secara total replikasi HIV-1 (Park, et al., 2002), demikian pula pelumpuhan oleh siRNA untuk gen pembungkus partikel HIV-1 gp120, mampu menekan ekspresi gen-gen HIV, dan menyebabkan penghambatan replikasi HIV dalam periode 14 hari (Park, et al., 2003). Demikian pula, RNAi yang ditransfeksi menggunakan lentivirus, dan diarahkan pada terbungkamnya koresptor HIV-1 (CCR5) pada sel-sel limfosit T manusia, menyebabkan penghambatan ekspresi CCR5 10 kali lipat selama dua minggu, serta memberikan proteksi substansial sejumlah populasi limfosit T terhadap infeksi virus HIV-1 CCR5-tropic (Qin et al., 2003).

3. Di seluruh dunia, hepatitis menjangkiti lebih dari 270 juta orang. Penelitian siRNA pada virus ini, membungkam (80%) mRNA (namun bukan genomic RNA) yang terlibat dalam replikasi HDV (Chang and Taylor, 2003). Percobaan yang mirip namun mentarget daerah tidak tertranslasi ujung 5’ genom HCV, hanya dengan 2.5 nM siRNA membungkam replikasi HCV 80% (Yokota et al., 2003). siRNA juga telah dipakai untuk membungkam ekspresi lamin A/C dan RNA-RNA HCV pada galur sel hepatoma Huh-7, mengurangi produksi RNA HCV 80 kali dalam 4 hari, menghambat produksi virion infektif virus hepatitis C (HCV), sehingga memulihkan 98% sel-sel terinfeksi (Randall et al., 2003; Wilson et al., 2003).

4. Virus influensa menyerang paling banyak orang, pada saluran pernafasan. siRNA pentarget gen untuk nucleocapsid atau RNA transcriptase menghilangkan akumulasi mRNA tersebut dan RNA virion (Ge et al., 2003). Hal ini memberi peluang kepada penggunaan siRNA sebagai inhibitor infeksi virus Influenza.

5. siRNA juga telah digunakan sebagai adjuvant –bahan yang meningkatkan respons- dalam pembunuhan sel-sel kanker oleh terapi radiasi dan kemoterapi. Dalam hal ini, siRNA (yang mentarget gen-gen yang terlibat dalam sistem proteksi kerusakan DNA, sehingga menyebabkan sel-sel tersebut menjadi sangat sensitif terhadap radiasi pengion dan alkylating agents) ditransfeksi ke dalam sel-sel yang akan diradiasi dan dikemoterapi. Dengan siRNA, dosis radiasi (dan alkylating agent) berkurang dengan faktor 1.4 untuk menimbulkan efek yang secara klinis relevan (Collis et al., 2003).

6. Kutu yang berkulit keras (Ixodes scapularis; Ixodidae) merupakan vektor sejumlah pathogen. Protein antikoagulasi yang terdapat pada kelenjar ludah Ixodes, Salp14 berfungsi memediasi proses infeksi mikrobial dan transmisi pathogen. Teknik RNAi mampu membungkan ekspresi gen Salp14, menurunkan aktifitas antikoagulasi kelenjar ludah, dan kemampuan makan Ixodes (Narasimhan et al., 2004).

7. Telomerase, adalah enzim yang bekerja menambah satuan berulang TTAGGG pada ujung telomere, dan melindungi sel dari proses penuaan (senesens). Ia aktif bekerja di hampir semua sel-sel tumor manusia, namun tidak pada sel-sel somatik yang normal. Penghambatan aktivitas Telomerase dengan siRNA menghambat aktivitas telomerase pada berbagai galur sel kanker. Penemuan ini dapat mencegah perkembangan sel-sel yang memiliki keuntungan selektif dimaksud dan menghambat perkembangan kanker pada stadium berbahaya Kosciolek et al (2003).

8. Demikian pula, siRNA sintetik sedang dikembangkan sebagai obat untuk terapi kanker (Sohail et al., 2003). Bahkan, siRNA sintetik membungkam p53 mutan, yang perbedaannya hanya satu pasang basah, dan memulihkan fungsi p53 asli (Martinez et al., 2002), dan memproteksi sel-sel dari instabilitas genom sebagai penyebab ±50% kanker pada manusia. Dan karena begitu spesifik, maka terapi antitumor yang bersifat orang-perorang dapat dikembangkan. Sel-sel kanker payudara yang malignan, bahkan dapat dicegah penyebaranya dengan penghambat aktifitas gen-gen CXC chemokine receptor-4 (CXCR4) menggunakan RNAi (Chen et al., 2003). Sering pula dalam pengobatan kanker, sel-selnya mengembangkan mekanisme kekebalan terhadap obat kanker. Ekspresi berlebihan Thymidylate synthase adalah salah satu penyebabnya. Pembungkaman (dengan siRNA) terhadap gen ini memulikan sensitifitas sel-sel kanker terhadap obat kanker (Schmitz et al., 2004).



siRNA juga telah digunakan untuk mengurangi rasa sakit akibat gangguan pada sistem saraf. Saluran kation P2X3 yang terkait dengan rasa salit (pain-related cation-channel P2X3) telah dibungkam dengan siRNA dan mengurangi rasa sakit, tanpa efek samping pada binatang percobaan (tikus). Hal ini memberi peluang pada pengembangan agen-agen terapi pada manusia (Dorn et al., 2004)